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            TUNEL凋亡

            TUNEL凋亡顯色法 

            TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法檢測細胞凋亡的原理是當細胞發生凋亡時,DNA內切酶被激活,核小 體間的基因組DNA被切斷,暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)加 上帶有生物素(Biotin)標記的dUTP即Biotin-dUTP,隨后于辣根過氧化物酶(HRP)標記的streptavidin結合,在HRP的催化 下通過DAB顯色來顯示凋亡細胞,從而可以通過普通光學顯微鏡檢測到細胞凋亡。 

            實驗意義 

            1.TUNEL法是一種分子生物學與形態學相結合的研究方法,可對完整的單個凋亡細胞或者凋亡小體進行原位染色,可以準 確反映細胞凋亡最典型的生物化學和形態特征。 

            2.可用于石蠟切片、冰凍切片、培養的細胞等進行細胞凋亡檢測,靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學方法要高。 

            3.操作簡便快捷,在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。 

            實驗步驟 

            1.石蠟切片TUNEL顯色法:

            ①石蠟切片常規脫蠟至水,脫蠟劑二甲苯,至水劑乙醇; 

            ②PBS漂洗3×5 min;

            ③加入蛋白酶K工作液37℃反應15-30 min, PBS漂洗3×5 min

            ④4%多.聚.甲.醛(pH7.4的PBS)室溫固定15-30 min,PBS漂洗3×5 min;

            ⑤浸入封閉液(3%H2O2)室溫封閉10 min,PBS漂洗3×5 min;

            ⑥加入適量TdT酶反應液,暗濕盒中37℃反應1 h,用SSC室溫15 min終止反應后,PBS漂洗3×5 min;

            ⑦浸入0.3% H2O2封閉內源性過氧化物酶活性,室溫孵育3-5 min,PBS漂洗3×5 min; 

            ⑧滴加Streptavidin-HRP工作液,37℃反應30-60 min,PBS漂洗3×5 min; 

            ⑨滴加DAB顯色液后用去離子水漂洗數次; 

            ⑩選擇是否用DAPI復染細胞核; ?脫水、透明、中性樹膠封片后進行觀察。

            2.冰凍切片TUNEL顯色法: 

            ①新鮮組織經處理后,立即在恒冷冰凍切片機內切片,厚度為5~6 μm;

            ②防脫玻片,貼片,室溫陰干約12 h; 

            ③4%多.聚.甲.醛(pH7.4的PBS)室溫固定10 min,PBS漂洗3×5 min;

            ④浸入封閉液(3%H2O2)室溫封閉10 min,PBS漂洗3×5 min;

            ⑤浸入通透液(0.1%Triton X-100溶于PBS中),室溫通透30 S-2 min; ⑥加入適量TdT酶反應液,暗濕盒中37℃反應1 h,用SSC室溫15 min終止反應后,PBS漂洗3×5 min;⑨滴加DAB顯色液后用去離子水漂洗數次; ⑩選擇是否用DAPI復染細胞核; ?脫水、透明、中性樹膠封片后進行觀察。 

            結果展示

            實驗完成周期及交付標準 

            1.實驗周期:1-2周 

            2.交付標準:蠟塊、切片、染色圖片、實驗報告(實驗步驟、試劑、耗材等) 

            需確認的信息 

            1.樣本的種屬 

            2.樣本的類型(固定的組織or蠟塊or切片) 

            3.是否提供試劑盒

            4.拍照要求 參考文獻

            收費標準/服務周期/提供結果: 

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