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            探針合成

            【星森林生物】探針是一小段單鏈DNA或者RNA片段(大約是20到500 bp),用于檢測與其互補的核酸序列。雙鏈DNA加熱 變性成為單鏈,隨后用放射性同位素(通常用磷-32)、螢光染料或者酶(如辣根過氧化物酶)標記成為探針。 

            實驗材料 基因 

            試劑、試劑盒 轉錄緩沖液 DTT RNA酶抑制劑 CTP ATP S-UTP 乙酸銨 乙醇 

            儀器、耗材 水溶鍋 離心機 培養箱 烘箱 

            實驗步驟 

            1.在一個含SP6、T3或T7啟動子的載體中,插入目的基因。在編碼序列下游酶切使質粒呈線性。DNA以酚/氯0 仿抽提,乙醇沉淀,70%乙醇洗后晾干。以無菌水重溶沉淀至1 μg/μl。 

            2.室溫配罝如下反應混合液(總體積20 μl): 

            (1)4.0 μl 5×轉錄緩沖液 

            (2)0.2 μl 1 mol/l DTT 

            (3)60 U RNA酶抑制劑 

            (4)1.0 μl 三種10 mmol/l NTP中的每一種 

            (5)1.0 μl 1 μg/μl 酶切DNA 

            (6)10.0 μl [35S]UTP 

            (7)16 U SP6或T7 RNA聚合酶 

            (8)37℃溫育30 min,再加16 U聚合酶并于37 ℃溫育40 min。 

            3.在反應混合液中加入:60 U RNA酶抑制劑,20 μl 10 mg/ml 的載體RNA和1.0 μl 酶1,于37℃溫育10 min 以 除去摸板。 

            4.往反應混合液加入以下液體:0.8 μl 1 mol/l DTT、63 μl 無菌水和10 μl 3 mol/l 乙酸鈉,取出1 μl 測定其 cpm/ μl 值。 

            5.加36.4 μl 7.5 mol/l的乙酸銨于反應混合液(終濃度2 mol/l)加50~100 μg tRNA載體和272 μl 冷無水乙醇,置 干冰上沉淀10 min,以冷70%乙醇洗沉淀,晾干,需要的話可重復此步。以100 μl 10 mmol/l DTT重溶DNA沉 淀。 6. 確定其 cpm/μl 值,并計算摻入百分比,核糖核酸探針應于2~3天內使用。 (70%到90%的標記摻入,結果可 得70~90 ng 標記的RNA)。



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