干細胞（Stem cell）即起源細胞。在細胞的分化過程中，細胞往往由于高度化分而完全失去了再分裂的能力，最終衰老死亡。機體在發展適應過程中為了彌補這一不足，保留了一部分未分化的原始細胞。因此，干細胞是一類具有自我更新和分化潛能的細胞。 

能自我更新和分化 

具自我復制的能力 

能在一定條件下分化成具有特定形態和功能的成熟細胞 

胚胎干細胞 

從囊胚期胚胎的內細胞團獲得 胚胎生殖細胞與胚胎干細胞都可自發分化形成三胚層的全部細胞。

成體干細胞

特定的組織中能自我更新并分化成相應組織內具有特定功能的成熟細胞可塑。

一、培養條件 

1.環境：細胞培養需要一個無菌的環境，所以盡量是在一個獨立的房間里進行。要求配有空氣凈化系統， 能夠對整個房間進行殺菌的紫外燈

2.設備：二氧化碳培養箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、冰箱、水浴鍋、離心機、實驗桌、移液器等。 

3.實驗耗材：一次性的細胞培養皿或細胞培養瓶、15ml或50ml離心管、脫脂棉花、封口膜等。

4.試剤：干細胞對培養條件要求較高，可以根據自己的條件，盡量選用質量好的各種試剤。 

試剤的配制： 

①DMEM培養基：去離子水中含1.34% DMEM粉末、0.22%NaHCO3 

②MEF培養基：DMEM培養基中含10%FBS, 1000u/ml青莓素,1000g/ml鏈霉素 

③ES培養基：ES培養基：DMEM培養基中含15% FBS, 1000u/ml青莓素，1000g/ml鏈霉素，1mM丙桐酸 鈉，0.1mM非必須氨基酸，2mM谷氨酰胺，0.1mM筑基乙醇，1000u/ml白血病抑制因子 

④D-Hank's： 0.8%NaCI，0.04%KCI， 0.035%NaHC03， 0.006%KH2P04，0.005325%Na2HP04, 0.001% 酚紅 

⑤0.1%明膠：D-HanK's溶液中含0.1%的明膠 

⑥ES細胞凍存酒：90% ES培養基，10% DMSO 

⑦MEF細胞凍存酒：90% MEF培養基，10% DMSO 

⑧Feeder 細胞凍存酒：90% FBS , 10% DMSO 

⑨絲裂莓素C：根據產品說明書來配制二、

培養步驟 

常見的干細胞培養是勝胎干細胞（ES cells）培養。我們以小鼠的胚胎干細胞培養為例。

1.小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryonic fibroblasts, MEF）的復蘇胚胎干細胞一般是在37℃、5%CO2和95%濕度的培養條件下，生長在鋪有一層滋養細胞層的細胞培養皿或者是細胞培養瓶中（此處以細胞培養皿為例）。因此要先鋪滋養層細胞。

①在37P水浴鍋里快速融化一管液氮凍存的小鼠胚胎成纖維細胞。 

②把融化的細胞懸浮酒加到裝有幾毫升預熱好的MEF培養基的無菌離心管中，輕輕混勻后,1000xg , 5min離心收集細胞。

③吸掉上清（除去凍存酒中的DMSO）,用10ml預熱的MEF培養基重懸細胞后，加到一個10cm的細胞培養皿 中，放入37℃，含有5%CO2的加濕培養箱中培養。

④根據情況對細胞進行換液，大約4天左右，細胞就可以基本長滴整個培養皿，這時可以進行傳代、凍存 或用于制備滋養細胞層。 

2. 滋養細胞層（feeder cells layer）的制備 

① 把長好的小鼠胚胎成纖維細胞的培養基吸掉，加入10ml新鮮的MEF培養基，并在避光的條件下加入 110μL 配好的絲裂莓素C,混勻后放入培養箱培養2h。 ② 把含有絲裂莓素C的培養基用無菌的15ml離心管收集起來避光保存，在一周之內可再次使用（直接使 用該培 養基處理細胞5hh。用PBS（不含二價離子）洗滌細胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化細胞，37°C培 養箱放置約3min,直到細胞懸浮起來。

③用1ml MEF培養基中和胰酶的作用，之后把細胞收集到離心管里，1000xg離心5min。 

④ 去掉上清，用1ml MEF培養基重懸細胞，之后把細胞平均分到兩個經過0.1 %明膠處理過的細胞培養皿 中，用MEF培養基培養細胞。（明膠處理：加5ml 0.1%的明膠到細胞培養皿中，在37°C培養箱中至少 放 10min,之后把明膠吸掉即可）

⑤ 一般處理好的小鼠胚胎成纖維細胞在1~2h之后即可以貼壁，形成滋養細胞層，這時的滋養細胞層即可 用來 培養小鼠胚胎干細胞。制備好的滋養細胞層可以在MEF培養基中保持1周左右的時間，或者是把細胞凍存。 

3. 小鼠胚胎干細胞（mouse embryonic stem cells, ES cells）的復蘇 

① 在37℃水浴鍋里快速融化一管液氮凍存的小鼠胚胎干細胞。 

② 把融化的細胞懸浮酒加到裝有幾毫升預熱好的ES培養基的無菌離心管中,輕輕混勻后,1000xg , 5min 離心收集細胞。 

③ 吸掉上清（除去凍存酒中的DMSO,用10ml預熱的ES培養基重懸細胞后，加到一個10cm的鋪有滋養細胞層的細胞培養皿中，放入37°C,含有5%CO2的加濕培養箱中培養。 

④ 根據情況對細胞進行換液，大約3~4天左右，細胞就可以基本長滴整個培養皿，這時可以進行傳代、凍存或用于后續試驗。

4. 小鼠胚胎干細胞的傳代

① 吸掉培養基，用PBS（不含二價離子）洗2~3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化細胞，37℃培養箱放置約 5min，直到細胞基本懸浮起來。 

② 用1ml ES培養基中和胰酶的作用，之后把細胞收集到離心管里，1000xg離心5min。

③ 去掉上清，用幾毫升ES培養基重懸細胞，之后根據培養皿規格和分配比，把細胞按一定比例分到鋪有 滋養細胞層的細胞培養皿中，加ES培養基培養。ES細胞的分配比可以是1：1到1：10。 

5. 小鼠胚胎干細胞的凍存

① 吸掉培養基，用PBS（不含二價離子）洗2-3次后，加1ml含有EDTA的胰酶消化細胞37°C培養箱放置約5min，直到細胞基本 懸浮起來

② 用1ml ES培養基中和胰酶的作用，之后把細胞收集到離心管里，1000xg離心5min。 

③ 去掉上清，用預先配制好的預冷的ES細胞凍存液來重懸細胞（凍存液的量視凍存的細胞量來定，一般 一個長滿的10cm細胞培養皿可以凍存4~6管）,按每管1 ml的量分裝到凍存管中。梯度降溫：4°C20min, -20°C20min, -80°C過夜后迅速轉入液氮中。

二、注意事項

1.絲裂莓素C在操作時要避光，避免其分解。 

2.ES細胞傾向于聚集生長，因此在復蘇時，要選擇好培養皿的規格。

3.ES細胞不能長的太滿，應避免使各個克隆之間接觸，以免發上分化。

4. 為避免水或血清帯來的污染，對血清應進行支原體檢測，配好的培養基要進行污染測試。