實驗操作流程：

（培養人臍靜脈內皮細胞為例） 

1、新生兒臍帶：在無菌條件下，于健康產婦分娩后立即取新生胎兒臍帶。長度>20 cm，兩端扎緊投入到 4℃臍帶保存液中，1h內送細胞培養室。 

2、剪去臍帶兩端和臍帶上有夾痕及血腫部分，盡量擠干凈臍帶內血液。 

3、用生理鹽水沖洗臍帶表面至無血色。 

4、用輸血器內接有穿刺器的軟管，找到臍靜脈，將軟管針頭一端插入臍靜脈，用止水夾固定，另一端接 20 m1注射器，吸取PBS反復沖洗臍靜脈直至無血色液體流出為止；將臍帶另一端用止血鉗夾閉，向臍靜脈中灌入0．1％ I型膠原酶溶液，使之充盈，夾閉軟管。

5、37℃水浴中孵育20 min，其間輕輕擠壓并旋轉臍帶，以使酶溶液充分接觸血管內壁。 

6、將細胞一酶溶液收集于預先裝有溫培養液小三角瓶中。用2倍于消化液的溫PBS沖洗臍靜脈，一并收集于小三角瓶中，將細胞懸液裝入10 ml離心管，1000 r／min離心10 min，棄上清，吹打懸浮，再次離心10 min，重懸細胞并接種于鋪有明膠的25 cm2培養瓶中，置于37℃ 5％ C02飽和濕度培養箱中培養，24h后更換培養液，以后每隔2d換液1次。 

7、臍靜脈內皮細胞的傳代培養：當原代細胞融合80％以上后，加入 0．05％ 胰蛋白酶一0．02％EDTA 溶液消化，倒置顯微鏡下觀察，當細胞皺縮變圓、彼此分離時棄消化液，加入細胞培養液終止消化，收集細胞懸液。1 000 r／min離心10 min，棄上清，制成單細胞懸液。此時可用0．5％臺盼藍染色，計算活細胞百分率，并以血細胞計數板計數。調整細胞濃度為1×10 個／ml，接種于培養瓶或培養板中繼續培養。待細胞長滿，彼此融合成片時依上述方法繼續傳代培養。

客戶提供： 

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